Opracowanie podejścia do hydrolizy białek w celu zwiększenia wartości odżywczych świeżo przygotowanego mięsa i ryb.
Naukowy artykuł pomocniczy autorstwa dr Adriana Hewsona-Hughesa | Doradca ds. żywienia, bezpieczeństwa żywności i innowacji, GA Pet Food Partners.
Wstęp.
Zawartość białka zwierzęcego jest dobrze ugruntowana jako istota najwyższej jakości karm dla psów i kotów, a wielu właścicieli zwierząt domowych zdaje sobie sprawę, że obowiązuje tu powiedzenie „jakość nad ilością”. Według firmy badawczej Mintel, 59% właścicieli kotów i 57% właścicieli psów twierdzi, że jakość mięsa jest ważniejsza niż ogólna zawartość mięsa w karmie dla zwierząt domowych (MINTEL, 2017).
GA Pet Food Partners od dawna to dostrzega. Od czasu wprowadzenia Freshtrusion®, GA jest liderem w opracowywaniu i wytwarzaniu diet zawierających coraz większe ilości świeżo przygotowanego mięsa i źródeł białka rybnego. Korzyści płynące ze stosowania świeżego mięsa i ryb w porównaniu z suszonymi, przetworzonymi posiłkami mięsnymi i rybnymi, w tym lepszy smak i zwiększona strawność, są doceniane zarówno przez zwierzęta domowe, jak i ich właścicieli.
Dążenie do oferowania naszym Partnerom jeszcze lepszych produktów.
Rynek karmy dla zwierząt domowych jest bardzo dynamiczny i chociaż podkreślanie dokładnego wysokiego udziału mięsa/ryb/drobiu w produktach jest mądrym posunięciem, staje się to raczej podstawowym oczekiwaniem niż pożądaną jakością tych produktów od właścicieli zwierząt domowych. W GA nieustannie szukamy sposobów, aby oferować Partnerom jeszcze lepsze produkty, dlatego postanowiliśmy zrobić pozornie niemożliwe – wymyślić sposób na ugotowanie naszych świeżych składników mięsnych i rybnych, aby były jeszcze lepsze dla zwierząt .
Chodzi o to, aby zwiększyć wartość odżywczą białka w naszych świeżych składnikach mięsnych i rybnych poprzez przekształcenie białka w małe peptydy, które są łatwiej przyswajalne przez jedzące je zwierzęta (nazywamy je „HDP” – wysokostrawne białko). Aby pomóc nam w tym poszukiwaniu, wybraliśmy ekspertów z Nofima, wiodącego instytutu badawczego zajmującego się badaniami żywności stosowanej z siedzibą w Norwegii, aby zoptymalizować warunki trawienia enzymatycznego wybranych surowców mięsnych i rybnych i przeanalizować je, aby wykazać, że możemy osiągnąć to, czego chcieliśmy .
Trawienie białka – inaczej proteoliza lub hydroliza
Białka to duże cząsteczki składające się z pojedynczych „cegiełek” zwanych aminokwasami. Po spożyciu pokarmu zawierającego białko rozpoczyna się proces proteolizy, gdy enzymy uwalniane w różnych częściach przewodu pokarmowego rozkładają go na aminokwasy i małe peptydy. Umożliwia to wchłanianie tych elementów budulcowych do organizmu, gdzie można je rekombinować w celu budowy nowych białek (takich jak mięśnie, skóra, włosy, przeciwciała, enzymy, hormony itp.).
Możliwe jest również, aby źródła białka podlegały kontrolowanemu procesowi proteolizy enzymatycznej w ramach ich przygotowania do włączenia do wytwarzanej żywności i produktów odżywczych. Na przykład, hydrolizaty białkowe są stosowane od dziesięcioleci w żywieniu ludzi, zwłaszcza w produkcji hipoalergicznych preparatów mlecznych dla niemowląt/dzieci uczulonych na białko mleka krowiego.
Hydroliza enzymatyczna lub chemiczna
Hydrolizę białek – zerwanie wiązań peptydowych łączących aminokwasy ze sobą poprzez dodanie wody – można osiągnąć różnymi metodami: chemicznie przy użyciu kwasów lub zasad (alkaliczne) lub enzymatycznie (podejście, na którym się skupiamy). Podczas gdy metody hydrolizy kwasowej i alkalicznej białek oferują zaletę polegającą na niskim koszcie, istnieją negatywne konsekwencje pod względem jakości odżywczej wytworzonych hydrolizatów. Hydroliza kwasowa powoduje całkowite zniszczenie niezbędnego aminokwasu tryptofanu, a także częściową utratę metioniny, cystyny i cysteiny (Pasupuleki i Braun, 2010). Podobnie hydroliza alkaliczna powoduje całkowite zniszczenie większości aminokwasów, chociaż tryptofan może przetrwać w stanie nienaruszonym (Dzień, i in., 2014) (Hu, i in., 2017).
W porównaniu z hydrolizą kwasową i zasadową, głównymi zaletami hydrolizy enzymatycznej białek są:
- Warunki hydrolizy, takie jak temperatura i pH, są łagodne i nie powodują żadnej znanej utraty aminokwasów.
- Zastosowanie enzymu(ów) proteazy jest bardziej specyficzne i precyzyjne w kontrolowaniu stopnia hydrolizy i wielkości peptydów.
- Niewielkie ilości użytego enzymu można łatwo dezaktywować (np. podgrzać do 80 – 85ºC przez co najmniej 3 minuty), aby zatrzymać reakcję hydrolizy. (Hu, i in., 2017).
Korzyści żywieniowe białka hydrolizowanego enzymatycznie: strawność i wchłanianie białka.
Oprócz zastosowanej metody hydrolizy białek, jak wspomniano wcześniej, wartość odżywcza hydrolizatów białkowych zależy od składu wolnych aminokwasów, małych peptydów (zwykle di- i tri-peptydów) oraz obecnych dużych peptydów. Historycznie uważano, że tylko wolne aminokwasy są wchłaniane z przewodu pokarmowego przez specyficzne transportery aminokwasów. Tak się dzieje, ale obecnie uznaje się, że większość aminokwasów jest absorbowana jako di- i tri-peptydy przez transporter peptydowy o szerokiej specyficzności PepT1 (Fej, i in., 1994). PepT1 może potencjalnie transportować wszystkie 400 dipeptydów i 8,000 tripeptydów, które powstają w wyniku połączenia 20 różnych aminokwasów w diecie (Daniel, 2004). Dlatego należałoby oczekiwać, że spożycie hydrolizatu białkowego zawierającego wysokie proporcje di- i tri-peptydów ułatwiłoby trawienie i wchłanianie białka, skutkując zwiększoną strawnością i biodostępnością aminokwasów.
Jasne jest, że ustalenie najlepszych warunków enzymatycznych i hydrolizy ma kluczowe znaczenie dla możliwości wytworzenia hydrolizatów białkowych o pożądanych profilach ostatecznej wielkości peptydów. Rozkład wielkości peptydów można określić za pomocą techniki zwanej chromatografią wykluczania wielkości. Chromatografia wykluczania (SEC) to technika chemii analitycznej, w której mieszaniny cząsteczek (takich jak białka lub peptydy) rozpuszczone w roztworze są rozdzielane według ich wielkości (jak przedstawiono na rysunku 1).
RYSUNEK 1. Prosty przegląd rozdziału cząsteczek o różnej wielkości w roztworze metodą chromatografii wykluczania (SEC). Roztwór nanosi się na kolumnę wypełnioną żywicą z porowatych kulistych kulek (szare kulki). Duże cząsteczki (czerwone kółka) nie będą w stanie wejść do porów (otworów) kulek i dlatego stosunkowo szybko przejdą przez kolumnę i zostaną wykryte jako pierwsze. Mniejsze cząsteczki w próbce mogą wchodzić do porów w różnym stopniu w zależności od ich wielkości. Cząsteczki „średniej wielkości” (zielone kółka) będą mogły wejść do niektórych kulek, ale nie do innych, przez co przejście przez kolumnę zajmie więcej czasu, podczas gdy najmniejsze cząsteczki (niebieskie kółka) będą mogły wejść do wszystkich porów i zajmą najdłużej przejść przez kolumnę.
Metody
surowce – Świeże próbki tuszy kurczaka, tuszki kaczki i ramek z łososia rozdrobniono, homogenizowano na gęstą pastę i zamrożono. Świeża wątroba jagnięca została zamrożona w całości. Materiały zostały wysłane do Nofima, Ås, Norwegia, do proteolizy i analizy.
Proteoliza – Dla każdego surowca (kurczaka, kaczki, łososia i jagnięciny) próbkę 500 g zmieszano z 990 ml wody destylowanej w szklanym naczyniu reakcyjnym i mieszano przy 300 obr./min. Dla każdego surowca testowano trzy różne enzymy proteazy w dwóch różnych stężeniach i dwóch punktach czasowych, co dało 48 próbek hydrolizatów do analizy.
Chromatografia wykluczania rozmiarów – Rozkład masy cząsteczkowej frakcji białek rozpuszczalnych w wodzie hydrolizatów określono metodą chromatografii wykluczania przy użyciu systemu wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) Shimadzu LC-20AT z detektorem z matrycą fotodiodową (SPD M20A) ustawionym na 214 nm.
Zawartość peptydu kolagenowego – Hydroksyprolina to zmodyfikowany aminokwas, którego obecność ogranicza się głównie do kolagenu. Zawartość hydroksyproliny w hydrolizatach białkowych może być wykorzystana jako pośrednia miara ilości obecnych peptydów kolagenu/kolagenu. Pełna analiza aminokwasów (w tym hydroksyproliny) każdego surowca została przeprowadzona przez Nofima Biolab; dodatkowo w akredytowanym laboratorium (ALS, Norwegia) oznaczono zawartość hydroksyproliny we frakcji rozpuszczalnej w wodzie hydrolizatów.
Efekt
Rozkład wielkości peptydów hydrolizatów – Ogólnie rzecz biorąc, dla każdego badanego enzymu inkubacja każdego surowca z wyższym stężeniem enzymu i przez dłuższy czas skutkowała „korzystną” zmianą profilu wielkości peptydów w hydrolizatach (tj. zwiększeniem proporcji mniejszych peptydów ). Podkreślono to na rysunku 2, który przedstawia wyniki dla każdego surowca przy użyciu „najlepszego” enzymu przy „nieoptymalnym” stężeniu i czasie trwania w porównaniu z „optymalnym” stężeniem i czasem trwania. W zoptymalizowanych warunkach stwierdziliśmy, że 100% peptydów miało wielkość ≤3 kDa, a ponad 75% miało wartość <0.5 kDa (Rysunek 2).
Na podstawie zbiorowych dowodów z kilku badań na wielu gatunkach (np. szczur, świnia, pies, człowiek; patrz (Zhangi i Matthews, 2010) ogólnie przyjmuje się, że:
- Wchłanianie peptydów jest lepsze w porównaniu z nienaruszonym białkiem.
- Wchłanianie peptydów jest lepsze niż wolnych aminokwasów.
- Wchłanianie małych peptydów jest lepsze niż dużych peptydów.
Fizjologicznie większość aminokwasów jest wchłaniana jako małe peptydy składające się z 2 lub 3 połączonych ze sobą aminokwasów (odpowiednio di- i tri-peptydy). Dlatego należałoby oczekiwać, że spożycie hydrolizatu białkowego zawierającego wysokie proporcje di- i tri-peptydów ułatwiłoby trawienie i wchłanianie białka, skutkując zwiększoną strawnością i biodostępnością aminokwasów. Średnia masa cząsteczkowa aminokwasu wynosi 110 Daltonów (Da), więc di- i tri-peptydy miałyby masę cząsteczkową około 220-330 Da (0.2-0.3 kDa). Nasze wyniki w uzyskaniu hydrolizatów białkowych z ponad 75% peptydów mniejszych niż 0.5 kDa (tj. do ~5 aminokwasów) oznaczają, że białko w naszych krokietach byłoby wysoce strawne i łatwo przyswajalne przez jedzące je zwierzęta. Planowane jest wykazanie tego poprzez badanie żywieniowe we współpracy z Wydziałem Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytetu w Gandawie.
Ponadto osiągnięcie 100% peptydów o masie 3 kDa lub mniejszej zmniejsza ryzyko wywołania reakcji alergicznej na źródła białka i dlatego można je uznać za hipoalergiczne.
Rysunek 2.
Rozkład wielkości (kDa) peptydów w fazie wodnej hydrolizatów każdego surowca inkubowanego z tym samym enzymem w warunkach „niezoptymalizowanych” i „zoptymalizowanych” pod względem stężenia enzymu i czasu trwania hydrolizy. W szczególności należy zwrócić uwagę, jak zmniejsza się odsetek peptydów między 1.0-3.0 kDa, a peptydy <0.5 kDa wzrasta, przechodząc od warunków „niezoptymalizowanych” do „zoptymalizowanych”.
Zawartość peptydu kolagenowego
W przypadku każdego badanego surowca enzymy A i C działały ogólnie „lepiej” (pod względem odzyskiwania większego procentu hydroksyproliny w fazie wodnej hydrolizatów) niż enzym B przy porównywaniu danego czasu trwania hydrolizy i stężenia enzymu (np. patrz wyniki dla łososia na rysunku 3).
Ponieważ „nienaruszone” białko kolagenowe nie jest rozpuszczalne w wodzie, obecność hydroksyproliny (naszego markera „kolagenu”) w fazie wodnej wskazuje, że białko kolagenowe zostało strawione na peptydy kolagenowe (które są rozpuszczalne w wodzie). Nasze wyniki pokazują, że jesteśmy w stanie wykorzystać proteolizę enzymatyczną do tworzenia surowców, które są w stanie przynieść potencjalne korzyści funkcjonalne, takie jak wspieranie zdrowia stawów, skóry i jelit poprzez obecne w nich peptydy kolagenowe.
RYSUNEK 3. Procent hydroksyproliny (aminokwasu występującego prawie wyłącznie w kolagenie) odzyskanego w fazie wodnej hydrolizowanego łososia za pomocą trzech różnych enzymów (A, B lub C) inkubowanych z surowcem (łososiem) w dwóch różnych stężeniach (C1 lub C2) dla dwa różne okresy czasu (T1 lub T2).
Podsumowanie
Te pozytywne wyniki dają możliwość uzyskania dodatkowej wartości dzięki naturalnej obecności kolagenu w niektórych surowcach poprzez tworzenie peptydów kolagenowych, które mogą zapewnić korzyści funkcjonalne, takie jak utrzymanie zdrowych stawów u aktywnych zwierząt domowych oraz poprawa mobilności i elastyczności stawów u starszych zwierząt, na przykład przykład.
Przy wysokim odsetku (>75%) małych peptydów (<0.5kDa) wytwarzanych w „zoptymalizowanych” warunkach w oparciu o te badania, pierwsza część naszego HDP cel został osiągnięty. Następnym ważnym krokiem jest wykazanie, że krokiety wykonane z tego HDP są rzeczywiście bardziej przyswajalne i biodostępne niż nasze istniejące świeżo przygotowane produkty – jesteśmy zajęci przeprowadzaniem tego w badaniu żywieniowym z udziałem Uniwersytet w Ghent Szkoła weterynaryjna. Obserwuj tą przestrzeń!
Referencje
- Cave, N., 2006. Hydrolizowane diety białkowe dla psów i kotów. Kliniki weterynaryjne Small Animal Practice, tom 36, s. 1251-1268.
- Dai, Z., Wu, Z., Jia, S. & Wu, G., 2014. Analiza składu aminokwasowego białek tkanek zwierzęcych i żywności jako przedkolumnowych pochodnych o-ftaldialdehydu metodą HPLC z detekcją fluorescencji.. J Chromatografia B, tom 964, str. 116-127.
- Daniel, H., 2004. Molekularna i integracyjna fizjologia transportu jelitowego peptydów. Annual Review of Physiology, tom 66, str. 361-384.
- Fei, Y. i wsp., 1994. Klonowanie ekspresyjne ssaczego transportera oligopeptydowego sprzężonego z protonami. Naturę, tom 7, str. 563-566.
- Hanaoka, K. et al., 2019. Charakterystyka masy cząsteczkowej białek i peptydów podczas produkcji podniebienia karmy dla zwierząt domowych. [Online] Dostępne pod adresem: https://www.diana-petfood.com/emea-en/publications/
- Hou, Y. i in., 2017. Hydrolizaty białkowe w żywieniu zwierząt: produkcja przemysłowa, bioaktywne peptydy i znaczenie funkcjonalne. Journal of Animal Science and Biotechnology, s. 24-36.
- Knights, R., 1985. Przetwarzanie i ocena hydrolizatów białkowych. W: Odżywianie dla potrzeb specjalnych. Nowy Jork: Marcel Dekker, s. 105-115.
- MINTEL, 2017. Większa przejrzystość pod względem zawartości białka w karmach, sl: MINTEL RAPORTS.
- Pasupuleki, VK, Braun, S, 2010. Najnowocześniejsza produkcja hydrolizatów białkowych. W: Hydrolizaty białkowe w biotechnologii. Nowy Jork: Springer, s. 11-32.
- Zhangi, B. & Matthews, J., 2010. Fizjologiczne znaczenie i mechanizmy wchłaniania hydrolizatu białkowego. W: Hydrolizaty białkowe w biotechnologii. Nowy Jork: Springer, s. 135-177.